کلونینگ و بیان ژن اوریکاز باکتری bacillus subtilis در سویه ی باکتریایی (bl21) e.coli

آنزیم اورات اکسیداز یا اوریکاز (ec 1.7.3.4) آنزیمی است که اکسیداسیون آنزیمی اسیداوریک به آلانتوئین را کاتالیز می کند. امروزه از این آنزیم در درمان بیماری های مرتبط با هایپراوریسمی همچون نقرس، سندروم متابولیک، سندروم لیز توموری و ... استفاده می شود. بر این اساس هدف از بررسی حاضر کلونینگ و بیان ژن اوریکاز باسیلوس سابتیلیس در سویه ی باکتریایی e.coliمی باشد. ابتدا dna ژنومی باسیلوس سابتیلیس به روش ctab استخراج شد سپس ژنوم استخراج شده بر روی ژل آگارز 1% بررسی شد. واکنش pcr جهت تکثیر ژن اوریکاز با استفاده از پرایمرهای پیشرو و معکوس طراحی شده بر اساس توالی ژن اوریکاز باسیلوس سابتیلیس به دست آمده از بانک اطلاعات ژنی، انجام گرفت. طراحی پرایمر به صورتی انجام گرفت که در پرایمر معکوس جایگاه برش ncoi و در پرایمر پیش رو جایگاه xhoi وجود داشته باشد. بعد از تکثیر، محصول pcr توسط آنزیم های ncoi و xhoi هضم شد و به داخل پلاسمید pet28a کلون گردید. محصول لایگیشن با استفاده از روش شیمیایی به ترتیب در سه سویه ی باکتریایی dh5?، top10 وbl21 ترانسفورم شد. بعد از تایید کلونینگ، القای بیان ژن اوریکاز در bl21 توسط iptg انجام گرفت. نتایج نشان داد که تکثیر ژن اوریکاز باسیلوس سابتیلیس از طریق واکنش pcr با موفقیت انجام گرفته است. نتایج حاصل از چک کلونینگ نشان داد که ترانسفورماسیون در dh5? صورت نگرفته است، در top10 ژن اوریکاز به صورت ناقص ترانسفورم شده ولی ترانسفورماسیون در bl21 به درستی انجام گرفته ا ست. علاوه بر این ژن اوریکاز بین جایگاه برش ncoi و xhoi در pet28a با موفقیت کلون گردید. داده های حاصل از تعیین توالی نشان داد که ژن اوریکاز در فرودست پروموتور t7 و بدون تغییر در قالب خواندن، کلون شده است.